İçerik
Ultraviyole ışığının (UV) absorbansını ölçerek RNA numunesinin miktarını ölçün. Bir nano-damla spektrofotometre, numunenizin sadece bir veya iki mikrolitresini kullanır; Diğer spektrofotometreler daha büyük bir örnek gerektirir. 1 cm ışık yolunda 260nm UV dalga boyunda nükleotitler için sönme katsayısı 20'dir. Bu sönme katsayısına dayanarak, aynı koşullar altında 40ug / ml RNA'nın emilimi birdir. Bu bilgiyi kullanarak, RNA numunesinin konsantrasyonunu hesaplayabilirsiniz.
Gerekirse, numunenizden bir seyreltme yapın. Bir mikro küvet için standart bir dilüsyon 1:40'tır. Bu dilüsyonu 78µL steril suya 2µL RNA örneği ekleyerek yapın.
Makineyi bir boşluk kullanarak kalibre etmek ve ardından numunenizin optik yoğunluğunu 260nm UV dalga boyunda belirlemek için kendi spektrofotometrenizin protokollerini izleyin.
Numunenizin absorbansını dilüsyon faktörünüzle 40μg RNA / mL ile çarpın. Denklem şöyle olacaktır: “RNA konsantrasyonu (µg / ml) = (OD260) x (dilüsyon faktörü) x (40 µg RNA / ml) / (1 OD260 birim))” (Hofstra.edu) Örneğin: Örneğinizi aşağıdaki şekilde sulandırdıysanız: 1:40 ve absorbans okuma değeriniz 0.08 idi, 0.08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0.13 µg / µL ile çarpın.
280nm UV dalga boyunda bir başka absorbans okuması alarak numunenizin saflığını hesaplayın. OD 260 / OD 280 oranı, numunenizin protein seviyesine veya fenol ile kontamine olup olmadığını - ve hangi seviyede - olduğunu gösterir. 1.8 ila 2.0'ın bir sonucu, kalite RNA'sını gösterir.