İçerik
Gram boyama, leke rengine bağlı olarak hangi bakterilerin Gram pozitif veya Gram negatif olduğunu gösteren farklı bir boyama prosedürüdür. Aseton alkol bu işlemde renk farklılaşmasını sağlamak için kullanılan bir reaktiftir. Gram-pozitif bakteriler kalın bir peptidoglikan tabakasına sahiptir ve mor renk alırken Gram-negatif mikroorganizmaların peptidoglikan tabakası çok azdır veya hiç pembe değildir.
Birincil Leke-Kristal Menekşe
Bir bakteri numunesi slaytı hazırlandıktan sonra, numuneyi önce boyamak için kristal menekşe kullanılır. Bu noktada hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakteriler mor gözükecektir. Genellikle kristal menekşe, suyla fazla lekeleri yıkamadan önce lam üzerine 30 saniye uygulanır. Kristal menekşe, peptidoglikan katmanlarına biraz yapışabilir, böylece tüm birincil lekeler suyla yıkanmaz.
Mordan-İyot
İyot sonra bir dakika boyunca numuneye eklenir. Boyaları boyama işleminde sabitlemeye yarayan bir mordan görevi görür. İyot bu işlevi kristal menekşe ile bağlayarak ve Gram-pozitif bakteriyel hücrelerde bulunan kalın peptidoglikan katmanına sadece kristal menekşe göre çok daha iyi yapışan çözünmeyen bir kompleks oluşturarak gerçekleştirir. İyot ilave edildikten sonra su ile yıkama aşaması yoktur.
Decolorizer-Alkol
Renk giderici ajan olarak aseton veya etil alkol kullanılabilir. Alkol, Gram negatif bakterilerin dış hücre zarında bulunan lipitleri çözerek kristal mor-iyot kompleksinin daha ince peptidoglikan katmanından sızmasına izin verir. Alkol 10 ila 20 saniye boyunca eklenir; bütün iyot yıkanana ve akma renksiz olana kadar kızak üzerine dökülür. Gram boyama prosesinde bu noktada, Gram negatif bakteriler renksizken Gram pozitif bakteriler kristal menekşeyi korurlar. Tamamlandıktan sonra renk giderici etkisini durdurmak için lamın suyla durulanması gerekir.
Counterstain-Safranin
Daha sonra renksiz Gram negatif bakterilerin görünürlüğünü ve kontrastını arttırmak için Safranin eklenir. Leke bu bakterilerin mikroskopta pembe görünmesini sağlar. Leke bütün numuneye eklendiğinden, aynı zamanda Gram pozitif bakterileri de boyar, ancak kristal menekşe rengi daha koyu olan safranin pembe rengini daha da gizler. Slayt numunesi yaklaşık bir dakika safranin ile sulandırıldıktan sonra, bakteriyel hücrelere yapışmayan fazla lekeleri yıkamak için su kullanılır.