İçerik
Jel elektroforezinde, DNA veya protein örnekleri - tipik olarak boyuta bağlı olarak - bir jelden geçmelerine neden olan bir elektrik alanı uygulanarak ayrılır. Jel elektroforezin kullanımı biyomedikal araştırma laboratuvarlarında rutindir ve çeşitli farklı soruları cevaplamak için kullanılır, bu nedenle sonuçları analiz etmek için gerçekten evrensel bir yol yoktur.
Western blot, Northern blot ve Southern blot gibi farklı tekniklerin tümü jel elektroforezi içerir.
DNA örneklerinin agaroz jel elektroforezini yapıyorsanız, en yaygın prosedür türü, tipik olarak en az iki şey yapmanız gerekecektir: 1) kesilmemiş plazmidleri kesici uçlardan, çentikli plazmidlerden ve kesilmiş plazmidlerden ayırmak ve 2) çeşitli boyutlarını tahmin etmek Standart bir eğri Excel veya hesap makinesi ile DNA parçaları.
Heres nasıl çalıştığını.
Hangi örneklerin hangi şeritlere yüklendiğini belirlemek için laboratuvar defterinize bakın. Jeli için kuyuları yüklediğinizde, her şeridin / örneğin kimliğini not etmiş olmalısınız.
Hangi şeridin DNA standartlarının "merdiveni" içerdiğini belirleyin. Bunlar bilinen uzunluktaki parçalardır; Geçiş mesafeleri, standart bir eğri Excel veya başka bir hesap makinesi kullanarak numune parçalarının boyutunu belirlemek için kullanılabilir.
Bir cetvel kullanarak, resminizdeki kuyucuklardan herhangi bir DNA bandından daha ileriye seyahat edecek olan takip boyasına olan mesafeyi ölçün (başka bir deyişle jelin altında olacaktır). Bu numarayı kaydedin - kullandığınız birimler önemli değildir.
Resminizdeki kuyucuklardan "merdivenin" her bir bandına olan mesafeyi ölçün, ardından bu mesafeyi izleme boya bandının kat ettiği mesafeye bölün. Bu hesaplama size her bandın göreceli hareketliliğini verir.
Örnek: İzleme boya bandının 6 inç gittiğini ve 5, 4.5 ve 3.5 inç seyahat eden üç grubumuz olduğunu varsayalım.
Göreceli hareketliliği nedir? Cevap: 0,833, 0,75 ve 0,5833 göreceli hareketliliklerini elde etmek için 5, 4,5 ve 3,5'i 6'ya bölüyoruz.
Göreceli mobiliteleri, çizelgedeki her bir parçanın kilobaz cinsinden büyüklüğü ile birlikte e-tablo programınıza (Excel veya kullandığınız benzer herhangi bir program) girin.
Üretici size tedarik ettikleri merdivenlerdeki her parçanın boyutunu verir, bu yüzden bu bilgilere zaten sahip olmalısınız.
Y üzerinde kilobaz cinsinden x ve boyutunda göreceli mobilite bulunan verileri grafik haline getirin.
Verilere bir denklem sığdırmak için elektronik tablo programınızdaki Eğilim Çizgisi işlevini kullanın. Bu denklem bir güç denklemi (örneğin, x ^ -2) olmalı ve verilere nispeten iyi uymalıdır (en az 0.9 R katsayısı). Bu bir eğri ve standart bir eğri Excel oluşturur.
Numunelerinize karşılık gelen bantlara bakın.
Küçük DNA parçalarının jelden büyük DNA parçalarına göre daha uzağa gittiğini unutmayın, bu nedenle izleme boyasına en yakın olanlar en küçük olacaktır. Bununla birlikte, eğer plazmid (dairesel) DNA kesilmemişse, "süper sarmal" veya telefon kablosu gibi büküleceğini ve bunun gerçekten hareket etmesine neden olacağını unutmayın daha uzağa Aynı büyüklükte lineer DNA.
Aynı şekilde, tamamen kesilmiş olan "çentikli" bir plazmid, daha kısa Aynı boyutta doğrusal DNA'dan uzaklık. Sonuç olarak, kesilmemiş plazmidlerin boyutunu jelinizden tahmin edemezsiniz.
Her şeritteki bantları o şeritte yüklediğiniz numunenin kimliği ile eşleştirin ve ne gördüğünün ne olacağını bekleyip istemediğinizi belirleyin. Bu, denemenizin niteliğine bağlı olacaktır.
Bununla birlikte, genel olarak, iki sınırlama enzimi olan bir ek plazmidini sindirdiyseniz, ekin plazmitten serbest kalmasını beklersiniz.
Plazmidden çok daha küçük olduğundan, bu şeritte biri üste, diğeri aşağıya doğru olan iki şerit görmeyi beklersiniz. Sadece bir kısıtlama enzimiyle kesilmiş bir plazmid, sadece iki kısıtlama enzimi ile kesilmiş plazmidden biraz daha uzağa hareket eden, ancak eke kadar hiçbir yerde tek bir bant oluşturmalıdır.
Kuyulardan kesim plazmidine olan mesafeyi ölçün ve cetvelinizle bantları yerleştirin. Eklerin ve kesilmiş plazmidlerin nispi hareketliliğini bulmak için bu boyayı izleme boyasının kat ettiği mesafeye bölün.
Eklerin göreceli hareketliliğini ve plazmitleri, elektronik tablo programınız sizin için hesaplanan denkleme takın. Bu hesaplama size bu plazmidlerin büyüklüğünün bir tahminini vermelidir.