İçerik
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile çalışırken, güvenilir ve kaliteli sonuçlar elde etmek için iyi kalibrasyon kesinlikle gereklidir. Bir HPLC cihazının doğru kalibrasyonu uygun bir kalibrasyon standardının yapılması ile başlar. Çoğu durumda, kalibrasyon aslında kalibrasyon eğrisi olarak bilinen bir şey üretmek için artan konsantrasyon standartlarını gerektirir. Bu, çizilen çizgi ve test edilen kimyasal maddenin konsantrasyonu ile HPLC dedektörünün tepkisi arasındaki ilişkiyi tanımlayan ilgili denklemdir.
HPLC'yi ("analit") kullanmak için test etmek istediğiniz kimyasal maddeyi belirleyin. Örneğin, fruktoz içeriği için bir dizi meşrubat test etmek isteyebilirsiniz, bu durumda fruktoz analit olur.
Uygun saflıkta bir miktar analit kimyasal elde edin. Normalde saflık% 99'un üzerinde olmalı ve analit saygın bir kimyasal tedarik şirketinden satın alınmalıdır. Örneğin fruktoz durumunda, bir marketten değil, kimyasal bir satıcıdan saf fruktoz alırsınız.
HPLC'de test etmeyi planladığınız örneklerde analitin maksimum ve minimum beklenen konsantrasyonlarını belirleyin. Alkolsüz içecekler söz konusu olduğunda, içeceklerin etiketlerini inceleyecek ve test edeceğiniz içecekler arasında en düşük ve en yüksek fruktoz içeriğini belirleyeceksiniz. İlk numunenin (alkolsüz içecek) analiz için hazırlık sırasında (kullanılan HPLC yöntemine bağlı olarak) seyreltilebileceğini veya başka şekilde manipüle edilebileceğini ve dolayısıyla HPLC'ye enjekte edilen numunelerdeki analit konsantrasyonunun değiştirilebileceğini unutmayın. Dikkate alınması gereken HPLC'de çalıştırılan numunelerdeki analit konsantrasyonu.
Kalibrasyon standartlarını oluşturmak için analitinizi çözeceğiniz çözücüyü belirleyin. Bu çözücü analiti nispeten geniş bir konsantrasyon aralığında (en azından test etmeyi düşündüğünüz örneklerde olduğu kadar yüksek) uygun şekilde çözebilmelidir. Aynı zamanda, bu çözücünün ideal olarak "mobil faz:" ile örnekleri HPLC aletinde taşımak için kullanılan çözücüye oldukça benzer olması gerekir.
Analitin "stok standardı" çözümü yapmak için gereken analit miktarını hesaplayın. Bu, stok standardının gerekli konsantrasyonunun istenen hacim ile çarpılmasıyla bulunur. Bu çözeltideki analit konsantrasyonu, beklenen en yüksek numune konsantrasyonundan en az% 10 daha yüksek olmalıdır. Meşrubat numunesinde beklenen en yüksek fruktoz konsantrasyonu 8 gram / 100 mililitre ise, stok standardı 10 gram fruktoz / 100 mililitre konsantrasyonunda yapılabilir. Makul bir hacim 500 mililitredir, bu nedenle 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fruktoz gerekli olacaktır.
Gerekli analit miktarını uygun bir hassasiyet seviyesine kadar tartın. Genellikle bir ya da iki ondalık basamağa hassas gram cinsinden bir ağırlık değeri uygundur, ancak bazı yöntemler için daha fazla hassasiyet gerekli olabilir.
Tartılmış analiti gerekli hacme sahip volumetrik bir şişeye aktarın ve istenen çözücüyü şişedeki doldurma işaretine ekleyin. Hacimsel bir şişenin kullanılması (örneğin derecelendirilmiş bir beher yerine) stok standardı konsantrasyon değerinin kesinliğini arttırır. Tüm analitlerin şişeye aktarıldığından emin olun; Gerekirse yıkamak için çözücünün bir kısmını kullanın.
Hacimsel şişeyi durdurun ve analit tamamen çözülene kadar hafifçe çalkalayın veya ters çevirin.
Stok standardının bilinen hacimlerini hacimsel şişelere aktararak, doğru transfer için pipetler kullanarak, sonra solvent ekleyerek stok standardının çeşitli dilüsyonlarını yapın. En düşük standart konsantrasyon, analiz edilecek en düşük tahmini numunenin altında olmalıdır. Meşrubat örneğinde, bir numunede beklenen en düşük fruktoz konsantrasyonu 2 gram / 100 mL ise, o zaman 1 gram / 100 mL standart yapılabilir. Bu, stok standardının on kat seyreltilmesiyle yapılır. Standart seri toplam 5 veya 6 konsantrasyon içermelidir, bu nedenle belki 3, 5 ve 8 gram fruktoz / mL standartlarını üretmek için ek seyreltmeler gerekli olacaktır. Artık HPLC'yi kalibre etmek için bir dizi standart çözüme sahipsiniz.