İçerik
- Kısıtlama Enzimleri ve Kısıtlama Siteleri
- Doğru Yönlendirme
- Ligasyon Yapışkan Uçları Daha Az DNA Gerektirir
- Farklı Enzimler Aynı Yapışkan Sonu Verebilir
Moleküler klonlama, her öğrencinin ve araştırmacının aşina olması gereken ortak bir biyoteknoloji yöntemidir. İnsan DNA'sını kesmek için daha sonra bir bakteri hücresinin plazmid DNA'sına yerleştirilebilecek parçalara kesmek için kısıtlama enzimi adı verilen bir enzim türü kullanarak moleküler klonlama. Kısıtlama enzimleri çift sarmallı DNA'yı yarıya indirir. Kısıtlama enzimine bağlı olarak, kesim yapışkan bir uca veya kör bir uca neden olabilir. Yapışkan uçlar moleküler klonlamada daha kullanışlıdır, çünkü insan DNA fragmanının plazmid içine doğru yönde yerleştirilmesini sağlarlar. Ligasyon işlemi veya DNA fragmanlarının kaynaşması, DNA'nın yapışkan uçları olduğunda daha az DNA gerektirir. Son olarak, çoklu yapışkan uç kısıtlama enzimleri, her bir enzim farklı bir kısıtlama dizisini tanımasına rağmen aynı yapışkan ucu üretebilir. Bu, ilgili DNA bölgenizin yapışkan uçlu enzimler tarafından kesilme olasılığını arttırır.
Kısıtlama Enzimleri ve Kısıtlama Siteleri
Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA üzerindeki spesifik dizileri tanıyan ve DNA'yı bu dizilimde yarıya indiren enzimlerdir. Tanınan diziye kısıtlama bölgesi denir. Kısıtlama enzimlerine endonükleazlar denir, çünkü DNA'nın uçları arasındaki yerlerde DNA'nın normal şekilde var olduğu şekilde çift sarmallı DNA'yı keserler. 90'dan fazla farklı kısıtlama enzimi vardır. Her biri ayrı bir kısıtlama sitesini tanır. Kısıtlama enzimleri, kendi sınırlama bölgelerini tanımadıkları diğer alanlardan 5.000 kat daha verimli bir şekilde ayırır.
Doğru Yönlendirme
Kısıtlama enzimleri iki genel sınıfta gelir. Ya DNA'yı yapışkan uçlara ya da kör uçlara keserler. Yapışkan bir uç, eşleştirilmemiş olan, DNA'nın yapı taşları olan kısa bir nükleotit bölgesine sahiptir. Bu eşleşmemiş bölgeye çıkıntı denir. Çıkıntının yapışkan olduğu söylenir, çünkü tamamlayıcı çıkma dizisine sahip olan başka bir yapışkan ucun olmasını ister ve eşleştirir. Yapışkan uçlar, birleştiklerinde birbirlerine sıkıca sarılmak isteyen, uzun zamandır kaybolmuş ikizler gibidir. Öte yandan, kör uçlar yapışkan değildir, çünkü tüm nükleotitler, DNA'nın iki ipliği arasında zaten eşleştirilmiştir. Yapışkan uçların avantajı, insan DNA'sının bir fragmanının bir bakteri plazmidine bir yönde sığabilmesidir. Buna karşılık, eğer hem insan DNA'sı hem de bakteriyel plazmid künt uçlara sahipse, insan DNA'sı plazmidin içine baştan kuyruğa veya baştan sona yerleştirilebilir.
Ligasyon Yapışkan Uçları Daha Az DNA Gerektirir
Yapışkan uçlu DNA, “yapışkanlık” nedeniyle birbirlerini bulmak için daha kolay bir zamana rağmen, ne yapışkan uçlar ne de kör uçlar sürekli bir DNA parçası halinde birleşemez. Tamamen bağlı sürekli bir DNA parçasının oluşumu ligaz denilen bir enzim gerektirir. Ligazlar yapışkan veya kör uçlardaki nükleotidlerin omurgalarını birleştirerek sürekli bir nükleotit zinciri oluşturur. Yapışkan uçlar, birbirlerine olan çekicilikleri nedeniyle birbirlerini daha hızlı buldukları için, ligasyon işlemi daha az insan DNA'sı ve daha az plazmid DNA gerektirir. DNA ve plazmidlerin künt uçlarının birbirini bulma olasılığı daha düşüktür ve bu nedenle künt uçların ligasyonu için test tüpüne daha fazla DNA konulması gerekir.
Farklı Enzimler Aynı Yapışkan Sonu Verebilir
Sınırlandırma bölgeleri organizma genomu boyunca bulunur, ancak eşit aralıklarla yerleştirilmez. Plazmitlerde, yan yana konumlandırılmak üzere tasarlanabilirler. İnsan genomundan bir insan DNA'sı parçasını kesmek isteyen bilim adamları, parçanın bölgesinin önünde ve arkasında bulunan kısıtlama alanlarını bulmalıdır. Bir DNA fragmanının doğru yöne yerleştirilmesini sağlamaya ek olarak, farklı yapışkan sekans enzimleri, farklı sınırlama sekanslarını tanımalarına rağmen aynı yapışkan ucu oluşturabilir. Örneğin, BamHI, BglII ve Sau3A farklı tanıma dizilerine sahiptir, ancak aynı GATC yapışkan ucunu üretmektedir. Bu, insan ilgilendiğiniz geninizi çevreleyen yapışkan sınırlandırma bölgelerinin bulunma olasılığını artırır.