İçerik
Western blot, biyokimyasal laboratuvarlardaki en yaygın prosedürlerden biridir. Temel olarak, bir numuneden proteinleri boyuta göre ayırır, daha sonra verilen bir proteinin mevcut olup olmadığını belirlemek için antikorları kullanarak test eder. Sadece araştırmada değil aynı zamanda tıbbi veya teşhis laboratuarlarında da faydalıdır; Hem HIV hem de Lyme hastalığı için testler, örneğin, bir enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) testini içerir, ardından ELISA pozitif ise testler yapılır. Popülerliğine rağmen, Western blotlama işleminin birkaç dezavantajı vardır.
Nonquantitative
Klasik Western lekeleri niteliksizdir. Başka bir deyişle, araştırmacılara belirli bir proteinin var olup olmadığını söyleyebilse de, proteinin ne kadarının mevcut olduğunu ölçmeyi mümkün kılmazlar. Bazı biyoteknoloji şirketleri şimdi araştırmacıların veya laboratuar teknisyenlerinin standart bir eğri kullanarak mevcut protein miktarını ölçmelerini sağlayan kitler satıyor - ancak bu yalnızca aynı proteinin saf örneklerinin mevcut olması durumunda işe yarar. Ayrıca, bir proteinin moleküler ağırlığı, kesin olarak kütle spektrometrisi ile belirlenmesinden ziyade, yalnızca Western lekelenmesi ile tahmin edilebilir.
Antikorlar
Western blot, ancak ilgilenilen proteine karşı birincil antikorlar mevcutsa gerçekleştirilebilir. Pek çok farklı protein için antikor biyoteknoloji şirketlerinden temin edilebilirken ucuz değildir; Eğer primer antikorlar belirli bir protein için mevcut değilse, o belirli proteini arayan Western blot yapmak mümkün olmayacaktır. Dahası, araştırmacılar bir proteinin bir şekilde değiştirilip değiştirilmediğini belirlemek isteyebilir - örneğin fosforile edilmişse (ona bağlı bir fosfat grubu varsa), örneğin - ve Western blot tekniği ile modifiye edilmeye özgü antikorlara ihtiyaçları var protein.
Eğitim
Western blotun düzgün şekilde yapılması ve iyi sonuçlar alınması zor olabilir, bu nedenle personelin iyi eğitilmiş olması gerekir.Bu konuda, diğer birçok konuda olduğu gibi, deneyim belki de en iyi öğretmendir; Ancak deneyimli bir teknisyen için bile bir Western blot zaman alıcıdır. Deneyin jel elektroforez kısmı, örneğin, çalışması tipik olarak bir ila iki saat sürer. Elbette, jel çalışırken başka görevler de yapılabilir, ancak deney sonuç almak için oldukça zaman alıyor.
Diğer Sınırlamalar
Antikorlar bazen daha kötü sonuçlar elde edebilecek bazı hedef dışı bağlanma sergileyebilir. Dahası, Western blot ile belirli bir proteine karşı bir antikor kullanıyorsunuz, bu nedenle sonuçlarınız size sadece o proteinin mevcut olup olmadığını söyleyecektir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi, aksine, bir numunede bulunan tüm proteinleri ortaya çıkarır ve klasik Western blot işleminin aksine, niceldir. Tabii ki, kütle spektrometrisinin Western blotlara kıyasla daha pahalı ve teknik olarak daha zor olduğunu hatırlamak önemlidir.