İçerik
Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, bir DNA parçasını fotosel olarak birçok parçaya - üstel olarak çok sayıda - fotokopisini çeken bir tekniktir. İlk adım PCR'de DNA'yı ısıtmak veya tek iplikçikler halinde eritilmesi için ısıtmaktır. DNA'nın yapısı, basamakların manyetik uçlu halatlar olduğu bir ip merdiveni gibidir. Mıknatıslar, baz çiftleri adı verilen basamakları oluşturmak için bağlanır ve böylece ayrılmaya karşı direnç gösterir. Her DNA parçası farklı sıcaklıklarda tek iplikçikler halinde erir. DNA'nın yapısının, DNA'nın münferit parçaları tarafından nasıl bir arada tutulduğunun anlaşılması, farklı DNA fragmanlarının neden farklı sıcaklıklarda eritildiği ve neden bu kadar yüksek sıcaklıkların gerekli olduğu konusunda fikir verecektir.
Erime! Erime!
PCR'nin ilk adımı DNA'yı eritmek ve böylece çift sarmallı DNA'nın tek sarmallı DNA'ya ayrılmasıdır. Memeli DNA'sı için bu ilk adım genellikle yaklaşık 95 derece Celcius (yaklaşık 200 Fahrenheit) sıcaklığını içerir. Bu sıcaklıkta, A-T ve G-C baz çiftleri arasındaki hidrojen bağları veya DNA merdivenindeki basamaklar ayrılır ve çift sarmallı DNA'yı açar. Bununla birlikte, sıcaklık, tek şeritleri oluşturan fosfat-şeker omurgasını veya merdivenin kutuplarını kıracak kadar sıcak değildir. Tek iplikçiklerin tamamen ayrılması, bunları primer olarak adlandırılan kısa DNA parçalarının tek iplikçiklere bağlanmasına izin vermek için soğutan ikinci PCR basamağı için hazırlar.
Manyetik Fermuarlar
DNA'nın 95 derecelik yüksek sıcaklığa ısıtılmasının bir nedeni, Celcius, DNA çift iplikçik ne kadar uzun olursa, birlikte kalmak o kadar fazla olur. DNA uzunluğu, o DNA parçası üzerinde PCR için seçilen erime noktasını etkileyen bir faktördür. A-T ve G-C bazı çift sarmallı yapıyı bir arada tutmak için çift sarmallı DNA bağında birbirleriyle eşleşir. İki tek iplikçik arasındaki ardışık baz çiftleri birbirine bağlı kaldıkça, komşuları da daha fazla birleşmek ister ve iki iplikçik arasındaki çekim daha güçlü hale gelir. Küçük mıknatıslardan yapılmış bir fermuar gibidir. Fermuarı kapattıkça, mıknatıslar doğal olarak fermuarlamak ve sıkıştırılmış kalmak isteyecektir.
Güçlü Mıknatıslar Daha Sıkıca Sopa
İlgilendiğiniz DNA fragmanı için hangi erime sıcaklığını seçeceğini etkileyen bir diğer faktör, o fragmandaki mevcut G-C baz çiftlerinin miktarıdır. Her bir baz çifti, çeken iki mini mıknatıs gibidir. G ve C'den yapılan bir çift, bir A ve T çiftinden çok daha fazla etkilenir. Bu nedenle başka bir parçadan daha fazla G-C çiftine sahip olan bir DNA parçası, tek iplikçikler halinde erimeden önce daha yüksek bir sıcaklık gerektirecektir. DNA doğal olarak ultraviyole ışığını emer - 260 nanometre dalga boyunda, tam olarak - ve tek iplikli DNA çift iplikli DNA'dan daha fazla ışık emer. Dolayısıyla, absorbe edilen ışığın miktarını ölçmek, çift sarmallı DNA'nızın tek sarmallara ne kadar eridiğini ölçmenin bir yoludur. G-C ve A-T baz çiftlerinin "manyetik fermuar" etkisi, sıcaklığın artmasına karşı çizilen çift sarmallı DNA'nın ışık emiliminin bir grafiğe dönüşmesine neden olan, bir S şeklinde, düz bir çizgide olmasına neden olan şeydir. S'nin eğrisi, baz çiftlerinin ısıya karşı uyguladıkları takım ayrıcalıklarını temsil eder, çünkü ayrılmak istemezler.
Yarım Nokta
Bir DNA uzunluğunun tek iplikçikler halinde eridiği sıcaklığa “Tm” kısaltmasıyla gösterilen erime sıcaklığı denir. Bu, bir çözeltideki DNA'nın yarısının tek iplikçikler halinde eridiği ve diğer yarısının erime sıcaklığıdır. hala çift iplikli formda. Erime sıcaklığı, her DNA parçası için farklıdır. Memeli DNA'sı,% 40'lık bir G-C içeriğine sahiptir, bu, baz çiftlerinin geri kalan% 60'ının As ve Ts olduğu anlamına gelir. % 40'lık G-C içeriği memeli DNA'sının 87 derece Celcius'ta (yaklaşık 189 Fahrenheit) erimesine neden olur. Bu nedenle, memeli DNA'sındaki ilk PCR basamağı onu 94 derece Celcius'a (201 Fahrenheit) ısıtmaktır. Erime sıcaklığından sadece yedi derece daha sıcaktır ve tüm çift teller tek tellere tamamen erir.