İçerik
Bir hücrenin genetik mavisi genetik materyali veya DNA'sı içinde kodlanır. DNA, hücrenin çekirdeğini asla terk etmediğinden, bu bilginin diğer proteinlerin ve biyokimyasal bileşenlerin bulunduğu sitoplazmaya girmesi için, önce DNA'yı haberci RNA (mRNA veya poli (A) RNA) 'ya aktarmak gerekir. Bu mRNA daha sonra hücrenin birçok fonksiyonunu yerine getiren proteinlere dönüştürülür. Çok nadir mRNA'ları tespit etmek veya ölçmek, mikrodiziler için problar yapmak veya tamamlayıcı DNA moleküllerinin kütüphanelerini oluşturmak için mRNA izole edilmelidir. Bununla birlikte, toplam RNA (yani, bir hücredeki tüm RNAlar) ekstraksiyonu ve ardından mRNA izolasyonu, birbirini dışlayan prosesler değildir; mRNA'nın çıkarılması için önceki işlemin gerçekleştirilmesi gerekir.
Toplam RNA'dan mRNA'nın İzolasyonu
TRIzol homojenleştirme: Toplam RNA, tüm mRNA, transfer RNA, ribozomal RNA ve diğer kodlayıcı olmayan RNA'ları içerir. Bunları diğer hücresel bileşenlerden ayırmak için, hücre ilk önce içeriğini serbest bırakmak üzere açılmıştır. Bu, TRIzol Reaktifinde (Life Technologies) santrifüjle (yüksek hızlarda döndürme) topak haline getirilmiş yeniden süspanse edilen hücreler tarafından yapılır. TRIzol'un diğer sürümleri (Ambion’daki TRI Reaktifi gibi) benzer şekilde çalışır.
Toplam RNA İzolasyonu: Hücrenin farklı bileşenlerini (proteinler, DNA, RNA) süspansiyon içinde tabakalara veya fazlara ayırmak için bir dizi santrifüjleme kullanılır. Üst, sarı renkli faz yağdan oluşur ve atılabilir. Arzu edilen faz kırmızı renklidir, toplam RNA'yı içerir ve korunur. Bir fenol-kloroform özümlemesi ve izopropanol ve etanol kullanılarak bir dizi alkol yıkaması yapıldıktan sonra, RNA, mRNA izolasyonu için topak haline getirilebilir. Bu enzimin toplam RNA'yı parçalamasını önlemek için RNase inhibitörleri ekleyin.
mRNA Ekstraksiyonu: Ev yapımı laboratuar protokolleri büyük miktarlarda yüksek oranda saflaştırılmış mRNA'lar üretmediğinden, mRNA'ları izole etmek için bir kit kullanılması yaygındır. Ticari kitler arasında Invitrogen’in FastTrack 2.0 veya Ambion’un Poly (A) Pure mRNA İzolasyon Kiti bulunmaktadır. Bu temel adımlar bu tür kitler için ortaktır:
a) Kitte sağlanan RNaz ile inhibe edilmiş lizis tamponunu, 300 mikrolitre toplam RNA ile karıştırın.
b) 65 santigrat derece sıcaklıkta 5 dakika ısıtın ve ardından numuneyi hemen bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun.
c) Bunu 0.5M Sodyum Klorür ile karıştırın ve daha sonra Oligo dT'yi (oligodeoksitimidilik asit) bu örnekte tamamen çözün.
d) Bu numuneyi santrifüje edin ve kitlerde sağlanan bir dizi bağlanma ve düşük tuz tamponu içinde birkaç kez yıkanan süpernatanı geri kazanın.
e) Kit tarafından belirtilen bir hacim (örneğin, 500 mikrolitre) elde edilinceye kadar mRNA'yı birkaç kez yıkayın.
f) Elüatı sodyum asetat ve etanol çökeltmesi ile çökeltin. 20 mikrolitreye kadar dietilpirokarbonat (DEPC) ile işlenmiş suyu tekrar askıya alın.
g) -80 santigrat derece sıcaklıkta depolayın ve spektrofotometri ile kaliteyi ve miktarı kontrol edin.